Informations utiles
La bonne amorce (comment réduire les risques de
choisir des "mauvaises" amorces)
Les oligonucléotides
"dégénérés": un
mélange de molécules d'ADN non
dégénérées
La nomenclature internationale des nucléotides
"dégénérés"
La
théorie de la synthèse d'ADN
D'autres fournisseurs d'ADN
La
bonne amorce (comment
réduire les risques de choisir des "mauvaises"
amorces)
Il y a plusieurs logiciels
sur le marché, qui vous aideront choisir la séquence d'un
oligonucléotide.
Vous pouvez trouver des renseignements et des versions "démo"
téléchargeables à l'aide des outils de recherche
sur le Web (Yahoo, Lycos, HotBot et
d'autres). Lorsque vous
choisissez une paire d'amorces pour la PCR, les règles de base
sont:
- Choisir
des amorces qui contiennent d'environ 50% de GC.
- Concentrer
la partie riche en GC de votre oligo à l'extrémité
5'.
- NE PAS
utiliser des séquences riches en GC dans
l'extrémité 3' de vos oligonucléotides.
Cependant, il est préférable d'avoir "GC clamps"
à l'extrémité 3'.
- Selon
certaines études un T à l’extrémité 3’
donne plus souvent d’appariements non spécifiques que les bases
A, G ou C (Kwok, S. et al.,
Nucl. Acids Res.
1990, 18, 999). Si vous désirez introduire des mutations
dans votre amorce, évitez de changer les trois bases à
l’extrémité 3’ (voir la référence
ci-dessus).
- Les
températures d'appariement des deux oligos doivent être
similaires ou identiques. La PCR a plus de chances de vous donner des
produits spécifiques à des températures
élevées, donc, la température d'appariement de
votre oligo ne doit pas être très basse.
- Si votre oligonucléotide est basé sur la
séquence d'un intron ou d'une autre séquence non codante,
soyez constamment conscients qu'il y a un danger de choisir une amorce
correspondante à une séquence répétitive
(Alu- et d'autres séquences répétitives).
- Faire des
recherches "BLAST" avec les séquences de vos oligos contre la
banque de données GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Les oligonucléotides
"dégénérés": un mélange de molécules d'ADN non
dégénérées
La nomenclature
internationale inclut des abréviations pour les bases "normales"
d'ADN : les purines G (Guanine) et A (Adénine), les pyrimidines
C (Cytosine) et
T (Thymine) ; en plus, il existe 11 lettres supplementaires
pour les bases "dégénérées". En fait, les
bases dans un oligonucléotide ne
sont pas dégénérées. Ce qui est
dégénéré
est la position, et non la base elle-même. Donc, lorsque vous
commandez votre
ADN, n'oubliez pas que mettre S (signifiant G ou C) dans la
séquence résultera
dans un produit dont environ 50 % des brins d'ADN auront G dans cette
position
et les autres 50 % posséderont C. Si dans la séquence de
votre oligonucléotide
commandé vous avez 4 positions
"N", c'est-à-dire des positions complètement
dégénérées (G ou A ou T
ou C = N), le produit final contiendra 256 types distincts de brins
complets
d'ADN. Si vous planifiez utiliser cet oligonucléotide
(en effet c'est un mélange équimolaire d'oligonucleotides
différents) pour une amplification par PCR et un clonage,
n'oubliez pas que
vous pouvez obtenir 256 clones différents (en plus, la PCR va
ajouter elle-même
des mutations).
Nous
synthétisons des oligonucléotides
à des
positions "dégénérées" sans frais
additionnels. Veuillez utiliser la
nomenclature internationale:
R = G ou A
K= G ou T
S = G ou C
W = A ou T
M = A ou C
Y = T ou C
D = G ou A ou T
V = G ou A ou C
B = G ou T ou C
H = A ou T ou C
N = G ou A ou T ou C
La
théorie de la synthèse d'ADN. Visitez le site de l’université
George Mason (Virginie, É.-U.) pour une brève description de
la chimie de synthèse d’ADN, par une série de diapositives.
Vous pourriez visiter le
site Web de l'Institut de cancer "Dana-Farber"
(Université Harvard, États-Unis) pour une
liste de fournisseurs d'ADN.
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