Nous synthétisons des oligonucléotides qui contiennent
des positions dégénérées (mélanges équimolaires)
sans frais additionnels. Ce sont des produits d'ADN dont certaines
positions ne sont pas décrites avec un seul caractère G,
A, T ou C, mais à l'aide d'autres caractères de l'alphabet
signifiant une combinaison de deux, trois ou toutes les quatre bases. Ces
caractères spéciaux respectent la nomenclature
internationale. Les mélanges non équimolaires sont
chargés seront les prix
ici.
Oligonucléotides à des bases modifiées
Les bases d'un oligonucléotide peuvent être modifiées de façon différente : elles peuvent être marquées à une substance fluorescente (par exemple, à la fluorescéine) ; au psoralène ; au cholestérol ; l’extrémité 5’ peut être phosphorylée ; le pivot de phosphate peur être remplacé partiellement ou entièrement par un pivot de phosphorothioate, etc. Nous synthétisons d’oligonucléotides modifiés, voici certains prix ici. Des rabais substantiels sont accordés si vous avez plus qu'une insertion du même type à commander, SVP renseignez-vous ici. Parfois nous avons besoin d'un temps supplémentaire (un jour ou plus) avant de commencer la synthèse, car nous n'avons pas de réserves de tous ces produits chimiques chers et rares.
Purification d'oligonucléotides - oligos dessalés, OPC, PAGE, HPLC
Les oligonucléotides de pureté "standard" sont normalement utilisables pour les PCR réguliers, le séquençage et l'hybridation. Tous les oligos sont "dessalés" sans frais suuplémentaires. Les purifications supplémentaires offerts par Alpha DNA sont : les colonnes de Sephadex G-25 (7$), l'OPC (oligonucléotides purifiés sur cartouche, 15$), HPLC (25$) et PAGE (35$), les prix sont pour l'échelle de 100 nmole.
La purification des oligonucléotides à OPC est meilleure que la précipitation à l'éthanol ou la colonne de Sephadex G-24, parce que l'OPC enlève non seulement le sel, mais aussi la plupart des produits avortés de la synthèse.
Oligonucléotides plus longs que 35-mères. Purification par PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis), purification par HPLC (high performance liquid chromatography)
Supposons que l'efficacité d'une synthèse d'ADN est de 99 %. Avec l'addition de chaque base consécutive, la proportion des oligonucléotides échoués augmente et à 40 bases la réaction finale contiendra 67 % de "vrais" oligos et 33 % de produits plus courts. À 100 cycles seulement 36 % des produits seront de la séquence correcte. Par conséquent, la synthèse de longs oligos nécessite une purification par PAGE, HPLC ou OPC. Pour les oligos plus longs que 50 bases, la purification par PAGE est supérieure à celle par HPLC ou OPC.
Nous offrons la purification d'oligonucléotides par PAGE, HPLC ou OPC. Nous requérons également 24 heures additionnelles pour compléter la purification. SVP noter que même la purification par PAGE (la meilleure des trois méthodes) ne garantie pas à 100% que vos oligonucléotides n'auront pas d'erreurs de synthèse. Selon un rapport, un 123-mère et un 126-mère, purifiés par PAGE et utilisés pour clonage, ont donné des clones mutants dans environ la moitié des cas (Hecker KH, Rill R. Error analysis of chemically synthesized polynucleotides. Biotechniques 1998 Feb;24:256-60).
Nous vous suggérons fortement à commander des purifications par OPC, HPLC ou PAGE pour vos longs oligos (35-40 bases ou plus). Toutefois, si vous préférez que nous vous fournissions le produit de base sans purification, nous pourrions accepter votre commande si vous confirmez formellement que vous voulez vos oligos non purifiés. Si vous commandez de longs oligos non purifiés, vous devrez affirmer que vous accepter ces longs produits sans garantie, et que vous êtes avertis que vous devez les purifier, préférablement par PAGE.
Oligonucléotides pour le clonage
Lorsque les oligos sont commandés pour être utilisés dans le clonage (habituellement pour une réaction de PCR, suivie par le clonage), il est fortement suggéré à commander ces oligos avec une purification supplémentaire, au moins par OPC. Cependant, même après une purification par OPC, HPLC ou PAGE, le client/la cliente doit considérer les dangers suivants :
1) Délétions internes. C'est la limitation la plus fréquente dans la synthèse chimique de l'ADN, qui ne pourrait pas être éliminée au complet par une purification supplémentaire ou par une autre méthode. La synthèse chimique d'ADN n'est pas aussi exacte que la synthèse d'ADN dans la cellule vivante. La dernière est caractérisée par des systèmes de "lecture d'erreurs" et de réparation, capables à réduire les infidélités dans les séquences jusqu'à une base mutée par million et même une par milliard. Même la fidélité de la réaction de PCR, au niveau d'une mutation par mille bases, est beaucoup plus élevée que la fidélité de la synthèse chimique, parce que le PCR est de nature enzymatique. Au contraire, la synthèse chimique d'ADN est une série de réactions non enzymatiques, dont la fidélité est d'environ une sur 100. L'efficacité de couplage (l'ajout de chaque nucléotide consécutif) est d'environ 99%. Les réactifs de CapA et CapB, en charge de bloquer l'extension des molécules avortées, ne sont pas 100% efficaces. La réaction de déblocage n'est pas 100% efficace, non plus. Un autre problème est l'interférence stérique des molécules d'ADN croissantes, entre elles-mêmes et avec les pores du support solide dans la colonne de synthèse. Cette interférence bloque le passage libre des réactifs dans les pores du support solide et diminue l'efficacité des réactions chimiques. Il n'existe pas des solutions 100% efficaces à ces problèmes. Par exemple, même le temps très longue d'incubation avec les réactifs de CapA et de CapB ne pourrait pas bloquer toutes les molécules non couplées. Lorsqu'on augmente le temps de déblocage ou la stringence du réactif de déblocage, ceci peut causer la dépurination d'ADN, cvd la perte des bases A et G. Par conséquence, un compromis entre le déblocage court (moins de dépurination, plus d'infidélités dans la séquence) et le déblocage long (plus de dépurination, moins d'infidélités dans la séquence) doit être atteint, auquel le déblocage incomplet et la dépurination existent en même temps. Les produits avec des délétions internes ne pouvont pas être enlevés facilement à 100%. L'OPC et le RP-HPLC ne sont pas efficaces contre les délétions internes, le PAGE est la meilleure méthode. L'OPC et l'HPLC ne sont que des différents types de chromatographie sur colonne, et le PAGE n'est qu'une électrophorèse en gel de polyacrylamide. Il est impossible de séparer les produits de taille complète (n) des produits de taille incomplète (n-1, n-2 etc) à 100%. La séparation est plus facile à des fins analytiques, lorsque des quantités très minimes sont chargées sur les colonnes ou le gel. Cependant, l'HPLC ou le PAGE préparatifs utilisent des quantités élevées d'ADN, ce qui empêche la bonne séparation et purification des molécules. Donc, un certain nombre des molécules délétées contamine toujours le produit final d'ADN synthétique, même après la purification supplémentaire. Puisque les infidélités dans la séquence surviennent au hasard dans des différents endroits (les molécules différentes ont des mutations différentes, et certaines molécules n'ont pas des mutations), ces infidélités ne posent pas de problèmes sérieux pour le PCR régulier, le séquençage ou l'hybridation d'ADN. Cependant, le clonage par sa nature est un processus de sélection et d'amplification d'une seule molécule; donc, lorsque la molécule originale porte une mutation, toutes les molécules dans le produit cloné porteront la même mutation.
2) L'insertion d'un nucléotide, par exemple la duplication d'une base G, est une autre infidélité fréquente dans certaines molécules du produit final. Lorsqu'une duplication G ou une autre insertion co-existe dans la même molécule avec la délétion d'un nucléotide, la taille finale de cette molécule sera égale à la taille des molécules de la séquence désirée ("sauvage") ; par conséquence, les méthodes de purification supplémentaire par HPLC ou PAGE seront incapables à séparer la molécule mutée des molécules de séquence correcte.
3) Les méthodes de purification supplémentaire - l'OPC, l'HPLC et en particulier le PAGE, sont des méthodes associées à des pertes de "bon" matériel : de 50% à 70% des "bonnes" molécules d'ADN (OPC, HPLC) et même de 70% à 90% des "bonnes" molécules (PAGE) seront perdues pendant la purification. Ceci diminue le rendement et pourrait nécessiter une plus grande échelle de synthèse afin d'arriver à la quantité désirée du produit final.
Ces limitations de la synthèse chimique d'ADN sont expliquées dans l'article de Hecker KH et Rill R (Error analysis of chemically synthesized polynucleotides. Biotechniques 1998 Feb;24:256-60). Dans cet article, les auteurs ont synthétisé et purifié par PAGE deux oligos très longs. Ensuite, ils ont utilisé les oligos pour PCR suivi par le clonage, et ils ont vérifié 10 clones. Dans les 10 clones, ils ont trouvé 7 délétions internes d'une base, une délétion interne de 4 bases et une transversion de G à C. D'autres infidélités de la synthèse chimique d'ADN existent, notamment les insertions d'un nucléotide, les branchements des oligos etc. Les infidélités des séquences sont présentes dans chaque oligo, de chaque compagnie, peu importe la compagnie ou la marque du synthétiseur d’ADN. Même si l’article de Hecker et al. date d'environ 15 ans (publié en 1998), très peu a changé dans la synthèse chimique d’ADN (la synthèse des oligonucléotides) dans les derniers 30-40 ans, c’est la même chimie (synthèse d'ADN à des phosphoramidites), même réactifs, même nature des réactions.
Il existe quelques méthodes ciblées sur les infidélités dans la séquence des oligonucléotides : a) la purification supplémentaire des oligos, aidée par des protocoles de synthèse spéciaux ; b) lorsque les oligos sont utilisés pour le clonage, tous les oligos (purifiés et non purifiés) peuvent donner des clones "mutants" (des clones avec des infidélités dans leur séquence), donc, la sélection et la vérification par séquençage de plus qu'un clone est fortement suggérée. En général, les chances de trouver un clone avec la séquence désirée sont très bonnes, à la condition que quelques clones réellement indépendants sont sélectionnés. À cet égard, c) une incubation plus courte en absence d'antibiotique est suggérée immédiatement après la transformation, parce que les incubations longues en absence d'antibiotique peuvent permettre l'amplification d'un clone mutant, qui par la suite pourrait donner plusieurs colonies "indépendantes" ; d) les colonies bactériennes devront être sélectionnées lorsque leur taille n'est pas grande ; e) lorsque c'est possible, il est préférable de synthétiser des oligos plus courts, parce que la quantité des infidélités augmente avec la longueur des oligos.
Le client ne doit pas être découragé par les remarques ci-dessus, il y a des bonnes chances de trouver le clone avec la séquence désirée, en particulier lorsque les oligos sont commandés avec une purification supplémentaire. De plus, les oligos (tous les oligos courts, et les oligos longs commandés avec la purification supplémentaire) sont couverts par notre garantie de remplacement gratuit ("remplacement gratuit sans questions à vous poser"). Les suggestions ci-dessus sont affichés pour informer les clients et les aider dans la sélection, l'acquisition et l'utilisation des oligos.
